Skip to content

Inaktywacja mutacji w genie 1-hydroksylazy D3 1-hydroksywitaminy u pacjentów z krzywicą pseudowitaminową D-Deficiency ad

2 miesiące ago

475 words

Rozpoznanie potwierdzono niskim stężeniem 1., 25-dihydroksywitaminy D w surowicy, gdy pacjenci mieli 10 do 20 lat, po zaprzestaniu leczenia witaminą D2 lub 1.-hydroksywitaminą D3. Rodzice Pacjenta byli drugimi kuzynami; te z Pacjenta 2 były pierwszymi kuzynami; te z Pacjenta 3 były niepowiązane i pochodziły z tego samego odległego obszaru; te z Pacjenta 4 były niepowiązane i pochodziły z różnych obszarów. Badania zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety ds. Przeglądu instytucjonalnego, a wszystkie podmioty wyraziły świadomą zgodę.
Izolacja cDNA 1.-hydroksylazy i Gene
Bibliotekę cDNA ludzkiej nerki przygotowano z poli (A) + RNA oczyszczonego z normalnej tkanki nerki19. Łącznie x 106 łysinek przeszukiwano przez hybrydyzację z mysim fragmentem cDNA 1.-hydroksylazy (0.7 kb) .16 Dwa pozytywne łysinki subklonowano i sekwencjonowano automatycznie w sekwenatorze DNA Prism 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA), z polimerazą DNA AmpliTaq FS (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.) i terminatorem barwnika.
Sekwencję genomową 1.-hydroksylazy określono przez sekwencjonowanie produktów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) amplifikowanych trzema zestawami starterów specyficznych dla eksonu i regionu nieulegającego translacji, z normalnym ludzkim DNA leukocytów jako matrycą.
Fluorescencja w hybrydyzacji in situ
Jako sondy zastosowano trzy ludzkie fragmenty genomowe obejmujące wszystkie obszary genu 1.-hydroksylazy. Fluorescencyjną hybrydyzację in situ przeprowadzono na ponad 20 chromosomach w prometafazie.20
Amplifikacja PCR i analiza sekwencji genu 1.-hydroksylazy
Genomowy DNA wszystkich pacjentów i członków rodziny ekstrahowano z białych krwinek obwodowych. Egzony genu 1.-hydroksylazy amplifikowano za pomocą PCR specyficznymi starterami pochodzącymi z sekwencji intronowych. Informacje o sekwencji starterów są dostępne w innym miejscu (NAPS). AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer) i jego standardowy bufor były stosowane we wszystkich reakcjach. Wszystkie eksony powielono w termocyklerze PCR (Perkin-Elmer) przez początkową denaturację w 95 ° C przez dziewięć minut, a następnie 30 cykli w 95 ° C przez jedną minutę, 60 ° C przez jedną minutę i 72 ° C przez jedną minutę . Odpowiednie produkty PCR oczyszczono i zsekwencjonowano bezpośrednio w obu kierunkach.
Konstrukcja plazmidowa
Ludzki cDNA 1.-hydroksylazy typu dzikiego wprowadzono do wektora ekspresyjnego pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), a mutacje pacjentów wprowadzono za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej miejscowo (Quick Change, Stratagene, La Jolla, Calif). .). Plazmid ekspresyjny dla domeny wiążącej ligand receptora witaminy D (VDR) połączonej z domeną wiążącą DNA GAL4 [GAL4-VDR (DEF)] wytworzono w sposób opisany w innym miejscu.21
Test aktywności 1.-hydroksylazy
Aktywność 1.-hydroksylazy badano zarówno za pomocą testu transaktywacji za pośrednictwem receptora witaminy D, jak i za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. [16] Krótko, w przypadku testu transaktywacji, w którym pośredniczy receptor witaminy D, komórki COS-1 przejściowo transfekowano 0,5 .g GAL4-VDR. (DEF), .g plazmidu reporterowego 17M2-G-CAT, 22 .g g plazmidów ekspresyjnych adrenodoksyny i reduktazy adrenodoksynowej, do 2 .g plazmidu ekspresyjnego 1.-hydroksylazy typu dzikiego lub zmutowanego i .g . -galaktozydazowy plazmid ekspresyjny pCH110 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja)
[hasła pokrewne: Mimośród, bromazepam, citalopram ]
[podobne: cystis epidermalis, serwatka z mleka owczego, allegro tangle teezer ]

0 thoughts on “Inaktywacja mutacji w genie 1-hydroksylazy D3 1-hydroksywitaminy u pacjentów z krzywicą pseudowitaminową D-Deficiency ad”