Skip to content

Inaktywacja mutacji w genie 1-hydroksylazy D3 1-hydroksywitaminy u pacjentów z krzywicą pseudowitaminową D-Deficiency cd

2 miesiące ago

430 words

Dwanaście godzin po transfekcji ligandy dodano do pożywki. Po inkubacji przez dodatkowe 36 godzin przygotowano ekstrakty komórkowe i zastosowano je do oznaczania acetylotransferazy chloramfenikolu. Do analizy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej komórki COS-1 transfekowano 0,5 .g plazmidów ekspresyjnych adrenodoksyny i reduktazy adrenodoksynowej i 3 .g plazmidu ekspresyjnego 1.-hydroksylazy typu dzikiego lub zmutowanego, a następnie inkubowano z trytowaną 25-hydroksywitaminą. D3 przez sześć godzin. Pożywkę inkubacyjną i komórki ekstrahowano i analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w normalnej fazie i w odwróconej fazie. Frakcje eluentu zebrano i radioaktywność oszacowano metodą zliczania scyntylacyjnego płynu.16,24,25 Autentyczne pochodne witaminy D poddano chromatografii, a czasy retencji określano na podstawie absorpcji w ultrafiolecie przy 264 nm.
Wyniki
Izolacja cDNA 25-hydroksywitaminy D3 1.-hydroksylazy i Gene
Klon cDNA o masie 2,4 kb wyizolowano z normalnej biblioteki cDNA ludzkiej nerki przy użyciu mysiego fragmentu cDNA 1.-hydroksylazy jako sondy. Ten cDNA zawiera otwartą ramkę odczytu o wielkości 1527 bp, przewidzianą do kodowania białka o 508 aminokwasach. Sekwencję tego cDNA zweryfikowano przez określenie sekwencji genomowej.
Sekwencja regionu kodującego była w 82% identyczna z sekwencją mysiej a-hydroksylazy na poziomie zarówno nukleotydów, jak i aminokwasów. [16] Wydedukowana sekwencja aminokwasów tego cDNA ma znaczną homologię z przedstawicielami mitochondrialnych rodzin P450, w szczególności ludzkich. 25-hydroksylaza witaminy D3 (CYP27, 40 procent), 27 25 hydroksywitaminy D3 24-hydroksylaza (CYP24, 32 procent), 28 P450scc (CYP11A, 33 procent), 29 i 11.-hydroksylaza (CYP11B1, 30 procent) .30
Strukturę ludzkiego genu 1.-hydroksylazy określono przez powielenie PCR normalnego ludzkiego DNA leukocytów, z użyciem specyficznych dla egzonów starterów zaprojektowanych z sekwencji cDNA, na podstawie odkrycia, że znani członkowie rodziny mitochondrialnych P450 mają zazwyczaj krótkie introny.31 Gen 1.-hydroksylazy składał się z dziewięciu eksonów obejmujących obszar około 4,8 kb.
Chromosomalna lokalizacja genu 1.-hydroksylazy
Figura 1. Figura 1. Lokalizacja chromosomu genu 1.-hydroksylazy według hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ. Panel A pokazuje fluorescencyjną hybrydyzację in situ z trzema fragmentami 1.-hydroksylazy genomowej pokrywającymi cały region kodujący jako sondy na preparatach chromosomowych otrzymanych ze stymulowanych fitohemaglutyniną limfocytów krwi. Sondy znakowano przez nicianową translację trifosforanu biotyny-16-dezoksyurydyny i wykrywano za pomocą awidyny-fluoresceiny (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy) .20 Precyzyjne mapowanie genu przeprowadzono z użyciem profazopodobnych środków do rozsiewania chromosomów z pasmem o wyższej rozdzielczości. Hoechst (pasmowanie G), jodek propidyny (wiązanie R) i obrazy awidyny-fluoresceiny zostały połączone i zabarwione odpowiednio na kolor niebieski, czerwony i zielony. Sygnały fluorescencji na chromosomach z paskami R są oznaczone strzałkami. Wstawka jest większym obrazem chromosomu 12 pokazującym precyzyjne odwzorowanie genu. Panel B pokazuje idiogram chromosomu 12 wskazujący lokalizację genu 1.-hydroksylazy do 12q13.3
[podobne: Leukocyturia, dronedaron, dekstran ]
[patrz też: storczyki allegro, olej rydzowy właściwości, leobert allegro ]

0 thoughts on “Inaktywacja mutacji w genie 1-hydroksylazy D3 1-hydroksywitaminy u pacjentów z krzywicą pseudowitaminową D-Deficiency cd”