Skip to content

ortopeda lublin jaczewskiego

2 miesiące ago

647 words

Białka te są obecne w innych tkankach szczura, takich jak mózg, wątroba i mięśnie, a także w innych gatunkach, takich jak człowiek i bydło (10). W związku z tym przeszukiwaliśmy bibliotekę ekspresji fagowej cDNA komórki HeLa dla białek, które wiążą mRNA PTH pełnej długości, ale nie sondę dla mRNA PTH bez 3 -UTR (Figura 1). Aby to zrobić, bibliotekę wysiano i przeniesiono na membrany, które hybrydyzowano ze znakowanymi transkryptami RNA PTH. Klonowanie tego ekspresji ujawniło 15 klonów, które wiążą mRNA PTH pełnej długości; tylko 3 z tych klonów były specyficzne dla 3 (3UT i nie wiązały sondy pozbawionej 3 -UTR. Wyniki te wskazują, że 3 -UTR było miejscem wiązania dla eksprymowanych białek. Jeden klon dodatkowo scharakteryzowano, ponieważ po sekwencjonowaniu okazało się, że jest identyczny z końcową trzecią COOH dla Dlc (Mr 8000) LC8. Wkładkę tego klonu zastosowano jako sondę do analizy Northern blot. Był pojedynczy transkrypt o wartości 700 nukleotydów, który jest przewidywaną wielkością cDNA ssaka Dlc (Mr 8000), który był eksprymowany w gruczołach przytarczyc szczura, jak również w innych tkankach i liniach komórkowych, takich jak komórki HeLa (T47D, komórka raka sutka). linia) i komórki HEK (ludzka zarodkowa nerka) 293 (nie pokazano). Analiza Western blot wykazała ekspresję białka LC8 w przytarczyce, jak również w innych tkankach, takich jak mózg (nie pokazano). Figura Mapa cDNA PTH i sond mRNA PTH stosowanych do skriningu biblioteki i testów wiązania białko-RNA. Wskazano sondy RNA reprezentujące różne części mRNA PTH. Wiązanie LC8 z sondami RNA, jak wykryto przez REMSA, jest wskazane jako niewykrywalne wiązanie (a) i wiązanie pozytywne (+). Aby zademonstrować wiązanie LC8 do RNA PTH, zrekombinowany LC8 przeprowadzono na żelu denaturującym, a następnie przeniesiono na membranę i hybrydyzowano z sondą RNA dla mRNA PTH. Zaskakująco, ten żel do badań przesiewowych Northwestern nie wykazywał wiązania (nie pokazano). Jednak żel Northwestern używa żelu denaturującego; w skriningu Northwestern, którego używaliśmy do identyfikacji LC8 jako białka wiążącego PTH RNA, białka zachowują swoją natywną strukturę, ponieważ są one hodowane bezpośrednio z kolonii bez denaturacji. Sugerowało to, że natywna struktura białka była ważna dla wiązania mRNA PTH. W związku z tym scharakteryzowano wiązanie LC8 do mRNA PTH w warunkach niedenaturowania, co byłoby podobne do warunków, w których LC8 klonowano przy użyciu biblioteki ekspresyjnej. W tym celu wykonaliśmy REMSA. Inkubowaliśmy rekombinowane LC8 z różnymi sondami mRNA PTH (Figura 1), trawiono mieszaninę RNazą T1 w celu strawienia niezwiązanego RNA, a następnie przepuszczano próbki na natywnym żelu. REMSA wykazał, że transkrypt PTH pełnej długości (figura 2a) i RNA 3 -UTR (fig. 2b) wiążą LC8 z pojedynczym pasmem o tym samym rozmiarze. Swoistość wiązania wykazano w doświadczeniach konkursowych (rysunek 2a). Wiązanie się z sondą mRNA pełnej długości PTH nie konkurowało o nadmiar mRNA PTH, który wykluczał 3 a -UTR (Figura 2a). Wiązanie było znacznie zmniejszone przez nadmiar zimnego 3 (3 -UTR (Figura 2a), jak również przez nadmiar mRNA PTH o pełnej długości (nie pokazano). Wskazuje to, że 3-PUT RNA zawiera miejsce wiązania do LC8. RNA 3 -UTR innego genu, CaSR (2), nie konkurował o wiązanie sondy mRNA pełnej długości PTH z LC8 (Figura 2a). Gdy nie dodano żadnego białka, nie wykryto pasma, co wskazuje, że sonda RNA była całkowicie strawiona przez RNazę T1 pod nieobecność białka (nie pokazano). Figura 2b pokazuje wiązanie z sondą 3 -UTR dla mRNA PTH. Proteinaza K eliminowała wiązanie (Figura 2b), a także wiązanie sondy pełnej długości (nie pokazano) wskazując, że białko, LC8, chroniło sondę mRNA
[patrz też: allegro tangle teezer, mielopatia szyjna objawy, acetylowany adypinian diskrobiowy ]

0 thoughts on “ortopeda lublin jaczewskiego”

  1. Taki sok jest smaczny, a witaminy i enzymy zawarte w nim działają natychmiast