Skip to content

pogoda wolin onet

4 miesiące ago

580 words

Hybrydyzację Northwestern przeprowadzono przez inkubację wstępnie nasączonych błon (2 x SSC) w buforze prehybrydyzacyjnym (10 mM HEPES, pH 7,6, 40 mM KCl, 5% glicerolu, mM DDT, 0,3 mM PMSF, 0,2% NP40, 0,5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Błony przemyto dwukrotnie buforem TNE (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, mM EDTA, mM DTT) i buforem do hybrydyzacji (10 mM HEPES, pH 7,6, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 8% glicerol), uzupełniony tRNA wolnym od RNazy o 5 mg / ml z Escherichia coli (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Niemcy), a sondę RNA (2 x 105 cpm) dodano przez 20 minut w 37 ° C, następnie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Błony przemyto dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 5 minut buforem TNE i klony wiążące RNA oglądano stosując autoradiografię. Fagi z pozytywnych łysinek zostały zastąpione w celu dodatkowej kontroli. Na czwartym badaniu wszystkie płytki były pozytywne, co wskazuje na jednorodny klon. Fagi z pozytywnej płytki izolowano i przekształcano w plazmidy. Plazmidowe DNA zsekwencjonowano stosując startery dostarczone z biblioteką. Sekwencje DNA i białka wykorzystano do przeszukiwania baz danych National Institutes of Health (NIH, Bethesda, Maryland, USA) i GCG Genebank (Madison, Wisconsin, USA). Analiza Northern blot. Całkowity RNA ekstrahowano z tkanki przytarczycznej szczura i linii komórkowych za pomocą Tri-odczynnika (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, Ohio, USA) i analizowano pod kątem poziomów mRNA, jak poprzednio (6), z losowo aktywowanymi cDNA dla PTH i klonowanego fragmentu. z biblioteki ekspresji. Do eksperymentów skojarzenia mikrotubuli przeprowadzono analizę Northern blot z cDNA dla PTH, CaSR i rybosomalnego RNA. Analiza Western blot dla łańcucha pośredniego LC8 i dyneiny. Ekstrakty białkowe poddano elektroforezie na żelu poliakrylamidowym SDS-10% (17) i elektrotransferowano na błonach nitrocelulozowych (0,2 .m, Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire, USA). Powstałe bloty blokowano w temperaturze pokojowej (1 godzinę) przy użyciu PBS zawierającego 5% sproszkowanego odtłuszczonego mleka i 0,3% Tween-20 (bufor blokujący). Bloty pozostawiono do przereagowania przez noc w temperaturze 4 ° C z oczyszczonym za pomocą blot króliczym przeciwciałem anty-dyneinowego łańcucha lekkiego (anty-Dlc) LC8 (1: 500), które rozpoznało zdenaturowaną postać LC8 (R4058) (18). Dla łańcucha pośredniego 74 dyneiny (IC74) zastosowano przeciwciało 74-1 (18). Błony przemywano PBS zawierającym 0,3% Tween-20 i inkubowano (1 godzina) ze sprzężonym z peroksydazą Affinipure kozim anty-króliczym (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pensylwania, USA) 1: 7 500 w PBS zawierającym 1% BSA. Po przemyciu bloty namoczono w systemie do wykrywania chemiluminescencji Renaissance Western blot (1 minuta) (DuPont-NEN, Boston, Massachusetts, USA) i krótko wysuszono. Immunoreaktywne prążki były oglądane za pomocą emisji światła na filmie Kodak. REMSA. Sondę RNA (1,5 x 104 cpm) inkubowano z 0,4 .g rekombinowanego LC8 (16) w końcowej objętości 20 .l zawierającej 10 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 40 mM KCl, 5% glicerol i mM DTT ( bufor wiążący). Po 20 minutach w temperaturze pokojowej, RNase T1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) dodano przez 10 minut w temperaturze pokojowej do końcowego stężenia 150 U / ml w celu strawienia niezabezpieczonego RNA. Następnie próbki nakładano na żel do elektroforezy poliakryloamidowej (40% akryloamidu, 70: 1) i prowadzono w zimnym pomieszczeniu. Wiązanie RNA-białko obserwowano za pomocą autoradiografii. W niektórych doświadczeniach dodano proteinazę K (1 mg / ml) przez 10 minut w 37 ° C. Do eksperymentów konkurencyjnych dodano nieznakowany RNA. Koncentracja RNA ze spolimeryzowaną tubuliną. Preparat białka mikrotubuli, składający się z tubuliny razem z białkami związanymi z mikrotubulami, został wyekstrahowany z mózgów cieląt zgodnie z naszą opublikowaną metodologią (19)
[przypisy: młody jęczmień allegro, żółty stolec, leobert allegro ]

0 thoughts on “pogoda wolin onet”