Skip to content

polopiryna s 300mg ulotka

2 miesiące ago

554 words

Zarówno plazmidy pMT p3 i pMT, jak również plazmidy pEGFP, zawierały gen oporności na neomycynę jako marker selekcyjny. Selekcję stabilnie transfekowanych komórek rozpoczęto 48 godzin po elektroporacji z G418 przy 900 .g / ml. Ponadto, 10 dni po rozpoczęciu selekcji G418, jasne, fluorescencyjne komórki o fluorescencji. Sortowano według FACS. i dalej hoduje się do ekspansji w ciągłej selekcji G418. Wielokrotne hodowle poliklonalne (> 98% GFP-dodatnich) przeszukiwano pod kątem C / EBP-cynku (o stężeniu 100 .M). nadekspresja metodą analizy Western blot. Analizy Western i Northern blot. C / EBP. ekspresję białka wykrywano za pomocą analizy Western blot, stosując całkowite lizaty komórkowe (30. g białka) i oczyszczone królicze poliklonalne anty-C / EBP. przeciwciało (18 .g / ml), jak opisano poprzednio (23, 24). Całkowite lizaty komórkowe z komórek COS-1 przejściowo transfekowane albo ludzkim C / EBP. Plazmid ekspresyjny cDNA (23) lub pusty wektor zastosowano równolegle jako kontrolę pozytywną i negatywną, odpowiednio. Aby zapewnić równomierne obciążenie lizatów komórkowych, albo wybrane żele białkowe barwiono, albo błony przenoszące usuwano i reprobowano za pomocą przeciwciała aktynowego (Oncogene, Cambridge, Massachusetts, USA). Całkowity RNA ekstrahowano za pomocą Trizol (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) zgodnie z instrukcjami producenta, przeniesiono na membranę nylonową i hybrydyzowano z 3 x 106 cpm / ml pełnej długości C / EBP. lub ludzkiej laktoferyny neutrofilowej (podarek od N. Berliner, Yale University, New Haven, Connecticut, USA) sondy cDNA, jak opisano poprzednio (22). Transfekcja i testy CAT. Transfekcje wykorzystywały 10 .g plazmidów reporterowych i 5 .g plazmidów ekspresyjnych w komórkach COS-1 przy użyciu lipofektyny (GIBCO BRL). Szesnaście godzin po dodaniu DNA komórki inkubowano przez dodatkowe 48 godzin w pożywce zawierającej 10% FCS pozbawionej węgla drzewnego z lub bez ATRA (1 MM) w 37 ° C, 5% CO2 i przeprowadzono testy CAT przy użyciu standardowych metod (38). Aktywność CAT oceniano ilościowo po autoradiografii za pomocą urządzenia Ambis Radioisotopic Imager (CSP Inc., Billerica, Massachusetts, USA). Podobnie, transfekcje przeprowadzono również w liniach komórkowych białaczki szpikowej U937 i KCL22 przez elektroporację z zastosowaniem aparatu do elektroporacji Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Aby skorygować różnice w skuteczności transfekcji, komórki kotransfekowano albo z plazmidem reporterowym RSV-lucyferazą albo pSV-gal, i odpowiednio mierzono produkcję światła lub aktywność galaktyczną. Przeprowadzono co najmniej 3 niezależne doświadczenia i obliczono średnią indukcję i SE. Testy zmiany wiązania i elektroforezy mobilności DNA. GST-RAR. i GST-RXR. białka fuzyjne wyrażano w Escherichia coli i oczyszczano przez wiązanie z glutationem-Sepharose zgodnie z instrukcjami producenta (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA). Dwuniciowe oligonukleotydy sekwencji RARE, które znajdują się przed C / EBP. (RAREC / EBP.) Znakowano [. -32P] ATP (Du Pont NEN Research Products, Boston, Massachusetts, USA) stosując kinazę polinukleotydową (GIBCO BRL). Równe ilości białek fuzyjnych GST RAR. i RXR. inkubowano z ng (50 000 cpm) radioznakowanej, dwuniciowej sondy DNA jak opisano wcześniej (38). Do rywalizacji wykorzystano rosnące ilości nieznakowanych oligonukleotydów typu dzikiego lub zmutowanych. Kompleksy DNA-białko rozdzielono przez elektroforezę za pomocą 4% żeli poliakryloamidowych, a następnie żel wysuszono i poddano autoradiografii z siatką intensyfikującą w ~ 80 ° C (38). Oznaczenie proliferacji, morfologii i apoptozy komórek. Komórki U937-pMT i U937-pMT 32 (104) hodowano w trzech powtórzeniach hodowlanych w pożywkach z lub bez ZnSO4 (100 uM), a średnie żywe komórki zliczano w dniach 0, 2, 5, 7, 9, 12 , i 14 po wykluczeniu błękitem trypanu
[hasła pokrewne: wodniak powrózka nasiennego, kątnica jelita grubego, rozpoznanie wg icd 10 ]

0 thoughts on “polopiryna s 300mg ulotka”