Skip to content

poradnia okulistyczna cieszyn

2 miesiące ago

570 words

Sto mikrogramów preparatu tubuliny (20 .M) w objętości 50 .l poddano polimeryzacji in vitro przez dodanie 20 .M paklitakselu (Sigma), .M GTP i 30% glicerolu i inkubowano w 37 ° C dla 10 minut. Całkowity RNA ekstrahowano z tkanki tłuszczowej tarczycy przez Tri-reagent (Molecular Research Center Inc.) (6), 2 .g całkowitego RNA dodano do zmontowanych mikrotubuli (paklitaksel, GTP) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić wiążący. Próbki umieszczono następnie na poduszce z sacharozą 200-30 L 30% i odwirowano przy 40 000 g przez godzinę w 20 ° C. W niektórych eksperymentach do preparatu mikrotubuli z RNA dodano rekombinowaną LC8 (0,2, 0,4 lub 2 ug). RNA ekstrahowano z peletek i supernatantów za pomocą Tri-odczynnika i analizowano metodą Northern blot dla mRNA PTH (6). W innych doświadczeniach RNA dla PTH lub 3 -UTR z CaSR transkrybowano in vitro, a 10 ng RNA inkubowano ze spolimeryzowanym preparatem mikrotubuli i osadzano, ekstrahowano i analizowano za pomocą analizy Northern blot jak powyżej. Montaż mikrotubul określano okresowo przy 350 nm. Ponadto, podwielokrotności peletki i supernatantu analizowano metodą mikroskopii elektronowej z ujemnym wybarwianiem w celu potwierdzenia złożonych spolimeryzowanych (paklitaksel, GTP) mikrotubul. Zbadano również związek endogennego mRNA PTH z mikrotubulami z przytarczycy szczura. Tkanka tarczycy z 6 szczurów została zhomogenizowana w buforze MES (1 mM) w obecności 200 U inhibitora RNazy (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) i 0,5 mM PMSF, a następnie odwirowana przy 40 000 g przez 40 minut w 4 ° C. DO. Przyspieszanie dobrano tak, aby umożliwić strącanie organelli i struktur cytoszkieletowych bez wytrącania rozpuszczalnych pierwiastków, takich jak tubulina, w monomerowej lub pierścieniowej strukturze. Supernatant uzupełniono 30% glicerolem i podzielono na 3 próbki. Paklitaksel (20 | jM) i GTP (1 mM) dodano do 2 próbek. Następnie do jednej z tych próbek dodano ATP (5 mM) i NaCl (1 M). Do trzeciej próbki nie dodano paklitakselu, GTP, ATP ani NaCl. W innym eksperymencie ATP i NaCl dodano oddzielnie, z paklitakselem i GTP. Próbki inkubowano przez 20 minut w 37 ° C w celu polimeryzacji mikrotubul, a następnie odwirowano przez poduszkę 30% sacharozy, jak poprzednio. RNA wyekstrahowano z peletki i supernatantu i analizowano za pomocą analizy Northern blot dla PTH i 18S RNA. Immunoprecypitacja łańcucha pośredniego z ekstraktów przytarczyc i analiza RNA. Tkanka tarczycy z 6 szczurów została zhomogenizowana w buforze do lizy (50 mM Tris, pH 8,1, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, inhibitor RNazy, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 10 ug / ml leupeptyny i 10 (ig / ml pepstatyny A). Homogenat odwirowano przy 4000 g przez 15 minut w 4 ° C, a odzyskany supernatant odpowiedział. Kulki z białkiem A-Sepharose (Sigma) przemyto i inkubowano z kołysaniem przeciwciałem IC lub surowicą przed immunizacją przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Kulki następnie przemyto 3 razy PBS i dodano do wstępnie oczyszczonego ekstraktu przytarczycznego 150 .g / ml tRNA drożdży (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Szwajcaria) i kołysano w 4 ° C przez 3 godziny. Ekstrakt przytarczyc oczyszczono przez inkubację ze wstępnie przepłukanymi perełkami białka A w obecności 60 .g / ml tRNA drożdży (Roche Molecular Biochemicals) w temperaturze 4 ° C przez 30 minut. RNA wyekstrahowano za pomocą Tri-odczynnika (Molecular Research Center, Inc.) z immunoprecypitowanej peletki perełek po wymywaniu buforem do przemywania (125 mM Tris, pH 8,1, M NaCl, 5 mM EDTA, 0,02% NaN3) i dodaniu 10. g drożdżowego tRNA (Roche Molecular Biochemicals). RNA przeprowadzono na żelu, poddano blottingowi, oglądano stosując barwienie bromkiem etydyny i hybrydyzowano do histonu PTH i H4, jak opisano poprzednio (6). Wyniki Wykazano, że białka cytoplazmatyczne z przytarczyc wiążą się z 3 (3UT mRNA szczurzego PTH (10)
[patrz też: acetylowany adypinian diskrobiowy, cystis epidermalis, leobert allegro ]

0 thoughts on “poradnia okulistyczna cieszyn”